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血友病基因检测

时间:2022-08-01 09:30:11 来源:网友整理 作者:网友

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世界血友病日丨基因检测和产前诊断可筛查血友病

图/IC photo

4月17日是世界血友病日。血友病是一种先天遗传性出血性疾病,也是罕见病的一种,可分为甲型血友病和乙型血友病,主要表现为关节、肌肉和深部组织出血,也可表现为胃肠道、中枢神经系统等内部脏器出血等。血友病患者又被称为“玻璃人”,他们的身体就如同玻璃一般,轻轻磕碰就可能血流不止。

北京大学人民医院儿科主任医师陆爱东介绍,大多数血友病患者,从出生起就会表现出流血不止的症状,例如疫苗接种后流血不止,磕碰后身上出现瘀斑等;也有极少数患者,由于病情相对较轻,成长至三四岁后活动变多时才会被发现。“新生儿如果发生反复出血,应及时前往医院检查。一旦确诊为血友病,应积极干预,科学治疗。”

儿童期是血友病治疗的黄金时期,虽然标准预防治疗不能使已有的关节病变逆转,却可以降低出血频率,延缓关节病变的进展并提高生活质量。北京儿童医院血液肿瘤中心吴润晖教授指出,预防治疗的第一个目标就是关节和肌肉不出血,让患儿健康长大,这也对儿童患者的护理提出要求。“家长和患者要学习相关知识,了解基本的治疗程序,做好记录,与就诊机构及时沟通。对于患者已经受损伤的关节如何进行康复锻炼、在学校做什么样的活动更适合等问题,都需要专业团队把关。”

“强化家长关于血友病的卫生宣传与教育,除日常减少磕碰、避免肌肉注射以及手术前补充凝血因子外,为避免血友病患者因反复关节腔出血导致残疾,建议患者每周输入2-3次凝血因子,使其保持一定水平,从而保证患者的正常活动不受影响。”陆爱东补充道。

血友病可以通过基因检测和产前诊断进行筛查。《罕见病诊疗指南(2019 年版)》中指出,血友病作为X染色体连锁的隐性遗传病,通过基因检测确定致病基因,不仅可以判断患者产生抑制物的风险,指导治疗,还可以鉴别患者家系中的携带者,为产前诊断提供依据。产前诊断以羊膜穿刺术和绒毛膜取样等技术为主要手段,对羊水、羊水细胞及绒毛膜进行遗传学分析,以判断胎儿的染色体或基因等是否正常。

新京报记者 刘旭

校对 刘军

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血友病的基因检测

血友病(hemophilia)是一种x染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病。其临床上分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺陷症)和血友病B(凝血因子Ⅸ缺陷症)两型,分别由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子IX(FIX)基因突变所致。在男性人群中,血友病A的发病率约为1/5000,血友病B的发病率约为1/25000;所有血友病男性患者中,血友病A约占80%~85%,血友病B约占15%~20%。女性血友病患者极其罕见。

血友病患者的临床诊断

出血表现:出血是血友病患者的重要临床特征,以自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血多见。出血部位常见于负重的大关节(如膝、肘、踝、腕、髂、肩等)和肌肉/软组织(腰方肌、上肢肌、下肢肌等)、内脏(如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等)、皮肤、黏膜(如皮肤淤血、鼻出血、口腔出血、牙龈出血等)。致命性出血有颅内出血、神经系统出血、咽颈部出血和无准备的创伤、手术出血等。

临床分型:根据患者出血的严重程度及其血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性(FⅧ:C)/凝血因子Ⅸ(FⅨ)活性(FⅨ:C)的水平,国内将血友病A/B分为4型(见表1)。

表1血友病A/B的临床分型

家系调查:血友病A/B是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,其缺陷基因位于X染色体上,由女性(母亲)携带,遗传给男性(儿子)发病。故诊断血友病A/B时,必须进行家系调查,约有2/3的患有阳性家族史。典型的血友病A/B家系调查结果见图1

实验检测:实验检测可为血友病A/B患者的诊断、鉴别诊断和替代治疗提供客观依据,非常重要。

1.筛查试验:

首选检查为活化的部分凝血活酶时间(APTT)和血浆凝血酶原时间(PT)。APTT延长而PT正常,则提示内源性凝血途径异常。但APTT延长不能鉴别血友病A和B,患者其他检测如血小板(PLT)计数、出血时间(BT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fg)含量等均正常。

2.确诊试验:

测定血浆FⅧ:C,辅以FⅧ抗原(FⅧ:Ag)可确诊血友病A;测定血浆FIX:C,辅以FⅨ抗原(FIX:Ag)可确诊血友病B。若患者的FⅧ:C/FⅨ:C或Fvm:Ag/FIX:Ag同时减低,提示FⅧ/FIX蛋白质合成和分泌减少:若其FⅧ:C/FⅨ:C减低而FⅧ:Ag/FIX:Ag正常.则提示FⅧ/FⅨ相应的分子功能异常

3.鉴别试验:

血友病A须与血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)和获得性血友病(acquired hemophilia,AH)相鉴别,可按表2所列试验鉴别两者。

表2血友病A的鉴别诊断实验

4. FⅧ/FIX抑制物检测:

临床上有反复应用血制品病史且对血制品治疗无效的血友病A/B患者,需高度怀疑是否出现FⅧ/FIX抑制物。首选进行APTT纠正试验(见图2),若结果呈阳性.再用Bethesda法或改良的Bethesda法(Nijmegen法)测定。

基因分析:

(1) 血友病A:

先测FⅧ内含子22倒位和内含子1倒位,可检出近50%的重型患者;遗传连锁分析检测FⅧ基因内、外8个短串联重复序列(STR)位点,包括DXS15、DXS52、DXS9901、葡萄糖_6一磷酸脱氢酶(G6PD)、DXS1073、DXS1108、F8civs22、F8eivsl3及性别基因位点等,基本可得出正确诊断。对上述检测尚不能诊断者,可直接测序以明确。

(2) 血友病B:

遗传连锁分析检测FIX基因外的6个STR位点,包括DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS8013、DXS1227及性别基因位点,基本可确诊。对上述检测尚不能诊断者,可直接测序以明确。

凝血因子Ⅷ(FⅧ)内含子22倒位和错义突变分别是重型和轻/中型血友病A发病的主要机制。CpG岛是突变热点。约5%的重症血友病患者由内含子1倒位引起。大片段缺失突变多与重复序列有关。插入/缺失突变常常发生在单碱基连续地方。无义突变和剪接位点突变多导致重度表型。错义突变的效应和其所累及的位置有关,如影响蛋白分泌,降低FⅧ与血管性血友病因子(vWF)、磷脂或因子Ⅸ(FIX )结合力、影响凝血酶活化以及增加FⅧ不稳定性等。

1. FⅧ基因和蛋白结构

FⅧ基因定位于Xq28,全长186 kb,包含26个外显子和25个内含子。 FⅧ cDNA全长约9 kb,编码长2 351个氨基酸的FⅧ前体。成熟的FⅧ根据内部序列之间的同源性,可以划分成3个A区,一个B区和2个C区,排列成与FV非常相似的A1-A2-B-A3-C1-C2构。 A1-A2、 A2-B和B-A3之间由短的富含带负电荷aa残基的酸性区域连接,分别称为a1、a2和a3区。FⅧ A区及C区分别和FV A区及C区具有40%序列相似性。FⅧ B区未发现与已知蛋白存在相似性,但其具有调节FⅧ分泌的作用。 FⅧ基因转录起始点上游1kb到下游148 bp范围内存在12个转录因子结合位点。此外, FⅧ基因内和上游还存在抑制子序列。目前尚未发现这些FⅧ顺式序列突变所导致的血友病A患者。

肝细胞是FⅧ的主要合成场所。内质网腔内相当一部分FⅧ与免疫球蛋白结合蛋白(Bip)等内质网蛋白相结合,以调节FⅧ的分泌。B区缺失的FⅧ表达量可增高5~10倍,这可能是由于B区缺失导致与Bip结合减少。在三磷酸腺苷供能下,FⅧ从Bip解离,并由内质网高尔基体间隙蛋白53 (endoplasmic reticulum Golgi intermediate compartment protein 53, ER-GIC-53)转运至内质网-高尔基体间隙,这种转运与B区富含的N-糖链有关,糖基化位点突变将导致分泌下降。另一方面,ERGIC-53蛋白缺失将导致发生遗传性FⅤ/FⅧ联合缺乏症。高尔基体内酪氨酸残基(364、718、719、721、1664和1680)硫酸化修饰对于凝血酶活化FⅧ以及FV/vWF结合具有重要意义。多数的FⅧ将在B区aa残基1648和1313等处被裂解,形成由一条重链(A1-A2-B)和一条轻链(A3 -C1-C2)通过亚铜离子维系成的异二聚体。定点突变实验表明, FⅧ与铜、钙离子结合位点位于A1区,后者已被定位到110A-126A,该区域氨基酸突变将导致FⅧ分泌下降,且辅因子活性下降。

血友病A突变致病分子机制

蛋白合成、加工和分泌缺陷

相关报道称发现C2区突变Arg2307突变(R2307Q和R2307L)将使得蛋白结构稳定性下降或者折叠错误导致分泌障碍,患者出现轻、中型血友病A。Phe652缺失不仅影响分泌,还导致突变蛋白的活性也下降。此外,A2区的Arg593Cys和C1区的Arg2150His突变也不同程度地影响了分泌。Arg2307和Arg2150在进化中都属于保守的aa,推测对于维持蛋白结构的稳定性可能具有重要作用。此外,三维结构分析显示这二aa都分别位于C1和C2区内部,突变有可能导致蛋白错误折叠,无法通过细胞内部的检查机制,从而被留滞在细胞内。

vWF结合能力下降

FⅧ分泌出高尔基体后就与vWF紧密结合,以防止FⅧ过早参与因子X激酶(Factor Xase,即FⅨa、FⅧa、磷脂和钙离子)复合物的形成和防止FⅧ被活化蛋白C等灭活,从而维持FⅧ血中的浓度。FⅧ与vWF的结合主要与FⅧ的A3酸性肽区(1669~1689)与C2区(2303~2332)有关。酸性肽区主要是维持C2区构象,使其能与vWF正确结合,该区Tyr1680Phe突变使FⅧ与vWF结合能力下降了80%。C2区的Ser2173Ile、Ala2201Pro (或缺失)、Val2232Ala、Trp2249Cys、Gln2246Arg、Pro2300Leu、Arg2304Cys/Gly与Arg2320Thr突变都可导致与vWF结合能力下降,患者出现轻/中度FⅧ缺乏。此外,有报道还发C1区突变也可能影响FⅧ/vWF的结合,如Ile2098Ser、Ser2119Tyr和Arg2150His突变使得FⅧ与vWF结合的亲和力分别下降了87.5%、99%和66.7%。Liu等也在FⅧ C1区鉴定到一批与影响vWF结合有关的突变,如Gln2087Glu、Arg2090Cys、Arg2150Cys、 Arg2159Cys、Arg2163Cys和Met2164Arg。这些突变所在aa,有些如Ile2098和Met2164埋藏在蛋白内部,不与vWF直接接触,但其突变却可极大地影响FⅧ结构的稳定性,改变FⅧ空间构象,从而间接影响到与vWF的结合;另有些突变,如Arg2090、Ser2119、Arg2150和Arg2159位于蛋白表面,推测其中一些可能直接参与了与vWF直接结合,但也有可能通过影响其临近的与vWF结合有关区域的构象,从而间接导致与vWF结合的亲和力下降。一些突变产生的效应具有多向性和累加性,如Arg2150His既影响了分泌,还同时导致vWF结合的亲和力下降。

影响凝血酶活化

凝血酶在Arg372、Arg740和Arg1689之间裂解并激活FⅧ,形成由A1、A2和A3-C1-C2三个片段构成的三聚体(FⅧa)。其中在Arg372和Arg1689处裂解导致FⅧ活性明显提高。这两位点突变,患者将出现中度血友病A表型,但有报道Arg1689突变也可产生严重表型,其原因尚不清楚。Tyr346虽然不是凝血酶裂解位点,但Tyr346翻译后硫酸化是凝血酶裂解的必要条件,Tyr346Cys突变将导致凝血酶活化FⅧ延迟,患者出现轻度表型。由于FⅧ:C二期凝固测定法和发色底物法所用的凝血酶孵育时间要长于一期法,因此患者将出现一期法测定结果比二期法/发色底物法结果低的现象。此外,该突变还可能影响了FⅧ a1区和FX a的相互作用。同样的,Glu321由于靠近Arg372凝血酶作用位点,其突变将会影响凝血酶的活化。

FⅧa不稳定性增加

FⅧ激活后,A1和A3-C1-C2之间仍然通过亚铜离子相维系,且A1区Ser289和A3区Tyr1979形成的氢键可以稳定三聚体复合物,而A2区只是以弱的静电作用与A1/A3-C1-C2二聚体相互作用,因此容易自行解离而导致FⅧa失活。肽结合抑制实验表明,FⅧa A2区(373~395、418~428和518~533)参与了和其他二聚体的结合。总的来说,位于或者临近A1-A2,如Ala284、 Arg531和Arg282, A1-A3,如Ser289与Tyr1979和A2-A3,如His1954、Asn694、Met1947和Arg698相互作用界面的aa突变将影响到整个复合物的构象结构稳定,从而导致A2区加速解离。由于二期法/发色底物法FⅧ孵育的时间要长于一期法,因此将出现一期法FⅧ:C测定结果高于二期法或者发色底物法的情况。

磷脂结合位点突变

FⅧ C2区的X射线晶体衍射三维模型和膜结合的FⅧ电子晶体学三维结构模型分析显示, FⅧ的C2区通过疏水和静电两种作用与磷脂膜紧密接触,其中4个β发夹状结构从C2区核心中伸出,顶点处的7个相邻氨基酸(Met2199/Phe2200;Trp2313/Val2314;Leu2551/Leu2252和Val2233)构成了铆钉状结构,可以楔入磷脂膜中。铆钉状结构下为一排碱性aa(Arg2215、 Arg2220、 Lys2227和Lys2249),可以通过氢键和盐桥与酸性的磷脂酰丝氨酸相互作用。迄今,以上7个与磷脂直接结合的氨基酸中,只发现1个存在突变(Val2233Met)。这可能是由于FⅧ与膜这种多重作用机制,使得即使单个aa突变,也无法产生足够的病理效应。

影响与FⅨa结合

FⅧ主要通过A3区(1811~1818)和FⅨ a以高亲和力结合。另外FⅧ的A2区(484~509、558~565和707~712)也可以弱亲和力与FIX a结合,但其主要作用是使FIX a的酶活性中心趋近底物FX。由于Glu720邻近FⅧ/FIX a结合位点,Glu720Lys突变将可能影响FⅧ/FⅨa结合,导致FⅧ: C一期凝固法测定结果降低,但发色底物法活性测定仍正常。


血友病B发病的分子机制

凝血因子IX(FIX)是凝血过程中重要的凝血因子,由组织因子和活化的凝血因子Ⅶ(TF/FⅦa)在凝血初始阶段中激活,所产生的活化的FⅨ很快与TF/FⅦa、组织因子途径抑制物(TFPI)形成四聚体复合物,进而终止TF/FⅦa 对凝血因子X(FX)和FIX的激活作用。但在活化的凝血因子Ⅷ(FⅧa)的辅助下,由活化的FⅨ(FⅨa)激活而生成的FXa是维持凝血过程和最终达到止血的关键;因此止血过程中起着不可替代的作用。FIX的编码基因(F9)位X染色体长臂(Xq27. 1~q27. 2),有8个外显子和7个内含子组成,该基因突变是导致血友病 B的根本原因。近年来,随着分子遗传学和分子生物学研究的进展,血友病B的基因诊断已经广泛应用于临床,迄今所发现的F9基因突变已逾千种。根据患者血浆中的 FIX抗原和活性的改变,将患者分为1)交叉反应物质阳性(CRM +):FⅨ:Ag含量正常而FⅨ:C明显降低,约 15%的患者属于此类型; 2)交叉反应物质减低(CRMR):FIX:Ag降低但不如FIX:C降低明显,此型患者约占25;3)交叉反应物质阴性(CRM-):FIX:Ag和FⅨ:C平行降低,60% 的患者为此型;前2型均为突变蛋白能够表达但无正常凝血功能,多为F9基因错义突变所致。


案例分享

患儿,男,6周岁,病史摘要:诊断血友病甲1年余,呕血2天入院。无特殊家族史,无近亲结婚。

样本送至基因检测,检测项目:血液及免疫缺陷病检测包+甲型血友病FVIII基因1号内含子倒位检测+甲型血友病FVIII基因22号内含子倒位检测

结果1. 在受检者F8基因发现:c.143+9A>T(编码区第143号核苷酸后内含子中第9位核苷酸由A变为T)的核苷酸变异,为剪切变异。

上述变异可能导致蛋白质功能受到影响。由于缺少受检者其父检验样本,未进行父亲来源验证工作;该变异的致病性尚未见文献报道(所参考数据库:HGMDPro及PubMed)。该变异不属于多态性变化,在人群中发生的频率极低(所参考数据库:1000Genomes、dbSNP)。F8基因是A型血友病(HemophiliaA)的致病基因,为X连锁隐性遗传方式(XR)。对于该类遗传方式,所发现的变异可能导致发病。在受检者F8基因所发现的变异遗传自受检者其母,其母为杂合子,符合X连锁隐性遗传方式,有可能为导致受检者发病的致病性变异。

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